Carlos Mackintosh Ginel, 4º de Biología, Universidad de Jaén baruna81@hotmail.com

Las roturas de doble cadena: son un tipo de lesión que parte el ADN. Sus causas más frecuentes son la radiación ionizante y los compuestos químicos aunque también pueden originarse cuando la maquinaria de replicación encuentra otro tipo de daños (como un corte de cadena simple) así como en procesos de recombinación en los que aparecen como intermediarios

Son importantes porque con sólo una DSB (abreviación de roturas de doble hélice en inglés) se puede inducir con eficiencia la muerte celular (en organismos superiores) y porque una mala reparación de estas lesiones puede causar mutaciones, deleciones, o translocaciones. Estas últimas pueden generar cromosomas acéntricos o dicéntricos, también muy peligrosos para la célula.

Sistemas de reparación: Aunque la molécula de ADN es bastante inerte a la degradación espontánea o inducida por el entorno, su enorme tamaño hace inevitable que ocurran lesiones. Así, se estima que una célula metabólicamente activa de mamífero padece unas 10000 alteraciones diarias en su genoma. Para corregir las alteraciones la célula ha desarrollado sistemas que los detectan, señalizan y finalmente reparan la lesión. Estos sistemas suelen ser específicos de un tipo de lesión concreta. En este artículo el autor se centra en los sistemas que reparan los daños del tipo rotura de doble hélice.

Enfermedades y terapias: defectos en los sistemas de detección, señalización y/o reparación provocan:

- inviabilidad de la célula o el organismo
- envejecimiento acelerado
- aumentan las tasas de cáncer

El conocimiento detallado de estos sistemas podría abrir nuevas puertas en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades humanas.

Reparación de las DBS por recombinación homóloga: esta es la ruta principal de reparación de DSB en organismos unicelulares. La RH (recombinación homóloga) implica la acción de los genes RAD50, MRE11 y XRS2 en S. cerevisiae, los productos de estos genes forman un complejo que produce un corte que extrae un segmento en los extremos 5′ de la zona donde está el DSB. A los extremos 3′ que resultas de ello se une la proteína Rad51, previa unión de Rad52 y 54. Rad 51 produce la invasión de cadena.

Finalmente el intermediario de Holliday se resuelve y sella (ligasa I). Es este un sistema preciso y fidedigno. Sólo se producen pérdidas de material genético cuando la zona lesionada está flanqueada por repeticiones directas. En humanos el homólogo de XRS2 es NBS1. Las alteraciones de éste y de Rad51 se asocian con el síndrome A-T y el síndrome de ruptura de Nijmegen. En humanos los genes de susceptibilidad al cáncer de mama, BRCA1 y BRCA2, parecen jugar una función de regulación de la RH.

Reparación de las DBS por unión no homóloga de extremos: mecanismo que los eucariotas superiores usan preferentemente. Básicamente consiste en que la ligasa IV repara la rotura en colaboración con una serie de proteínas: forma complejo junto con XRCC4 que se une al extremo de ADN lesionado cuando previamente se ha unido la proteína Ku, que aparte de a este complejo se une a la proteína kinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs) y la activa en su función de fosforilación. Parece ser que mediante la fosforilación del complejo de la ligasa esta enzima regula el proceso activando temporalmente la acción de la ligasa, aunque también podría hacerlo interfiriendo en la estructura de la cromatina y/o interfiriendo con procesos competidores como la transcripción. Este mecanismo es bastante más propenso a cometer errores pero no necesita que haya una secencia hermana inalterada ni requiere recombinación, a diferencia del sistema anterior.

El proceso descrito de unión directa de los extremos de la rotura parece no ser el más frecuente sino que parece existir un procesamiento previo mediante actividad nucleasa, de lo cual se encarga en S. cerevisiae el complejo Rad50-Mre11-Xrs2 y en mamíferos, la proteína Artemis.

Señalización de las DSBs: la señalización consiste en parar el ciclo celular para que actúe la reparación en el sitio de la lesión. Molecularmente se conoce sólo que sucede una cascada de fosforilaciones que detienen la replicación, el ciclo celular y también la transcripción. En S. cerevisiae las enzimas halladas que intervienen son Mec1 y Tel1, cuyos homólogos en mamíferos son respectivamente ATR (proteína ataxiatelangiectasia) y ATM (proteína ataxia-telangiectasia mutada), todas ellas con actividad kinasa. La deficiencia de esta última conduce al síndrome homónimo. Parece ser que se unen al ADN en la lesión (o a una proteína previamente unida al ADN) y producen la señalización mediante la cascada de fosforilaciones.

Los resultados parecen indicar también que ante una lesión la ATM fosforila al supresor p53 y al gen BRCA (que vimos estaba implicado en la reparación por HR) lo cual refuerza la idea de que están en enzimas son las que disparan el estado de protección y reparación. Recientemente se han identificado otros genes implicados en la cascada de señalización, como es el LCD1 en levadura, cuyo producto se une a Mec1 y actúa sobre ella de manera aun no bien conocida, haciéndola reconocer la lesión, regulando su actividad quinasa o ayudandola a unirse a la lesión, no está aún claro.

Conexiones entre señalización de ADN dañado y reparación:

1.- En zonas circundantes a la rotura de doble hélice se observa que las histonas H2AX (una variante de la histona H2A) de las células de mamífero se encuentran fosforiladas y la estructura de la cromatina en esas zonas es abierta. Lo que sucede es que ante la rotura, las enzimas ATS y ATM (implicadas como hemos visto en la señalización) actúan fosforilando a esas histonas, produciéndose en consecuencia la relajación de la cromatina y facilitando por tanto la entrada de los sistemas de reparación en la zona dañada. El mecanismo es aún poco conocido.

2.- Por otra parte, se está demostrando que proteínas implicadas en la reparación pueden tener que ver con la señalización. Es el caso de Rad14 y Rad2 en levadura. Diferentes experiencias muestran que si estos genes están alteradas los daños no se reconocen. También ocurre con el complejo Rad50-Mrc11-Xrs2, pues cuando se halla mutado en levaduras, los mecanismos de checkpoint (la parada del ciclo celular para que ocurra la reparación) están ausentes.

Se ha demostrado que en la iniciación de checkpoints se encuentra la acción nucleasa de este complejo que actúa activando la ruta de señalización Tel1/Mec1. A la vez, daños en el ADN hacen que Tel1 fosforile a Xrs2 (ATM fosforila a NBS1 en mamíferos). La secuencia quedaría: Tel1 (de la cascada de señalización) reonoce (directa o indirectamente) la lesión y activa al complejo Rad-Mrc-Xrs que a su vez con su acción nucleasa inicia la detención del ciclo activando (directamente o indirectamente) a la señalización por cascada de fosforilaciones de Mec/Tel. Se dice que el bcomplejo Rad-Mrc-Xrs actúa como modulador de la señal de daño.

Inestabilidad genética en el cáncer humano causado por deficiencia en el sistema de reparación por emparejamiento

Este artículo trata de un ejemplo claro de cáncer relacionado con un sistema de reparación deficiente. Se trata de un tipo de cáncer (cáncer de inestabilidad en el microsatélite, abreviado MSI-H) muy concreto con un cierto fenotipo clínico, que surge cuando en el microsatélite1 (codificante y no codificante) se acumulan mutaciones, frecuentemente pequeñas deleciones que cambian el marco de lectura de los genes, que activan o desactivan genes funcionales entre los que se encuentran genes encargados de regular el crecimiento celular o la apoptosis, de lo cual deriva el tumor. La causa de que estas mutaciones en el microsatélite sean extraordinariamente altas en este cáncer se debe en la mayoría de los casos a que existe una mutación de base en los sistemas de reparación por emparejamiento, por lo que se trata de un cáncer hereditario. En el 10-15 % de los casos no es hereditario y se debe a un silenciamiento epigenético y bialélico de uno de los genes de ese sistema de reparación (hMLH1). Extrañamente, es cáncer MSI-H tiene una mayor incidencia en el sexo femenino, se desconoce la razón.

El origen hereditario también puede estribar en la mutación de un gen supresor de tumores aunque nunca son el APC ni el p53 (por lo menos en el cancer MSI-H de tipo colorrectal, que es el más estudiado). Tanto en caso de mutación en el sistema de reparación como en el de supresión de tumores tiene que haber homozigosis por razones obvias. Sin embargo, en algunos casos un cambio de marco puede originar que se vea afectado más de un gen con lo cual el efecto puede puede ser dominante negativo. No siempre se tienen que producir como consecuencia de la inestabilidad una inactivación, el ejemplo es que el TCF-4 (factor de transcripción) se ha encontrado en pacientes de esta enfermedad alterado de tal manera que no se unía al represor transcripcional CtBP, por lo que si hiperactivaba su función. El caso es que se observó que había una serie de genes (los que contenían microsatélite en su región codificante) que se hallaban mutados con gran frecuencia en los pacientes de MSI-H (el receptor tipo II para la hormona del crecimiento por poner un ejemplo) y que tenían una importante función represora de tumores o reparadora (por otra parte, otro grupo de genes mutados se presentaba con menor frecuencia, lo cual encajaba con su papel poco importante en la oncogénesis). Se empezaron a usar aquellos genes como “genes diana para le inestabilidad”, es decir, si en un análisis en una paciente se encontraban mutados se podía inferir que se trataba de un tumor MSI-H.

Más tarde se vio que con este mismo fin se podía usar el microsatélite no codificante (que por supuesto también se altera) como marcador aún más eficaz. Concretamente se establecieron 5 regiones de microsatélite, tales que ante la presencia de por lo menos 2 de ellos se podía aceptar que se trataba de un MSH-I. Es decir, si estudiando la muestra de un paciente observamos que dos de estas cinco regiones de microsatélite están alteradas podemos diagnosticar un cáncer MSI-H en ese paciente.

Los más representativos eran dos marcadores intrónicos (Bat-25 y Bat-26) debido a que son monomórficos en casi toda la población (presentan siempre el mismo número de repeticiones). Estudiando aún más el tema se observó que se podía establecer una relación entre el tamaño de la deleción en esos marcadores con el estado de progresión del cáncer: los tumores más avanzados presentaban cada vez más acortados los marcadores Bat, de manera que se podían utilizar a modo de relojes moleculares. Es decir, las muestras en que se observen pequeñas deleciones pertenecerán a un paciente con un cáncer incipiente o aún no activo mientras que cuando estén muy delecionados se tratará de tumores muy desarrollados.

Se observaba que en la progresión, el TGFâ-RII era casi siempre el primer gen en alterarse en las fases más tempranas de la la evolución tumoral (marcadores Bat casi completos) y que hacia el final (marcadores Bat casi inexistentes) se producía una alteración secundaria (porque hay que contar con la alteración primera que origina la inestabilidad) de genes del sistema de reparación por emparejamiento, lo cual a su vez realimentaba la fuente que mantenía la inestabilidad. Esto encajaba con el enfoque de los genes diana de inestabilidad.

La capacidad para diagnosticar con facilidad el cáncer MSI-H mediante estos métodos ha supuesto que sea uno de los que mejor pronóstico tienen, con una supervivencia (o ausencia de recurrencia durante 4 años) del 90% de los afectados.

1 Microsatélite: secuencias cortas que se repiten en tándem (una a continuación de otra). Son zonas del ADN difíciles de replicar en las que la polimerasa comete frecuentes errores. En individuos sanos el sistema de reparación por emparejamento los repara pero en personas con defectos en ese sistema se acumulan las mutaciones en el microsatélite, lo cual da nombre a esta patología: cáncer por inestabilidad del microsatélite.

Bibliografía:
- Detecting, signalling and repairing DNA double-strand breaks. S.P. Jackson. The Wellcome Trust and Cancer Research Campaign, Institute of Cancer and Developmental Biology, University of Cambridge. Julio 2001
- Genetic instability in human mismatch repair deficient cancers. Alex Duval & Richard Hamelin. Abril 2002